離心分離方法介紹

一）差速離心法
　　它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復加高轉速，逐級分離出所需要的物質。
　　差速離心的分辨率不高，沉淀系數在同一個數量級內的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。
　　（二）速率區帶離心法
　　速率區帶離心法是在離心前于離心管內先裝入密度梯度介質（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉軸處（X1）的介質密度最小，離旋轉軸最遠處（X2）介質的密度最大，但最大介質密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。這種方法是根據分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內分成一系列區帶，達到彼此分離的目的。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質和穩定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。
　　由于ρP＞ρm可知S＞0，因此該離心法的離心時間要嚴格控制，既有足夠的時間使各種粒子在介質梯度中形成區帶，又要控制在任一粒子達到沉淀前。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達離心管底部；離心時間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質本身大小的影響較大，一般是應用在物質大小相異而密度相同的情況。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。
　　（三）等密度離心法
　　等密度離心法是在離心前預先配制介質的密度梯度，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，當梯度液由于離心力的作用逐漸形成底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時原來分布均勻的粒子也發生重新分布。當管底介質的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP時粒子上浮；在彎頂處ρP＞ρm時，則粒子沉降，最后粒子進入到一個它本身的密度位置即ρP＝ρm，此時dx/dt為零粒子不再移動，粒子形成純組份的區帶，與樣品粒子的密度有關，而與粒子的大小和其他參數無關，因此只要轉速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。
　　此法一般應用于物質的大小相近，而密度差異較大時。常用的梯度液是CsCl。
　　（四）梯度溶液的制備
　　⒈梯度材料的選擇原則作為一種理想的梯度材料應具備以下幾點：①與被分離的生物材料不發生反應即完全惰性，且易與所分離的生物粒子分開。②可達到要求的密度范圍，且在所要求的密度范圍內，粘度低，滲透壓低，離子強度和pH變化較小。③不會對離心設備發生腐蝕作用。④容易純化，價格便宜或容易回收。⑤濃度便于測定，如具有折光率。⑥對于超速離心分析工作來說，它的物理性質、熱力學性質應該是已知的。這些條件是理想條件，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料：①糖類：蔗糖、甘油、聚蔗糖（Ficoll）、右旋糖酐、糖原。②無機鹽類：CsCl（氯化銫）、RbCl（氯化銣）、NaCl、KBr等。③有機碘化物：三碘苯甲酰葡萄糖胺（matrizamide）等。④硅溶膠：如Percoll。⑤蛋白質：如牛血清白蛋白。⑥重水。⑦非水溶性有機物：如氟代碳等。
　　⒉梯度材料的應用范圍
　　⑴蔗糖：水溶性大，性質穩定，滲透壓較高，其最高密度可達1.33g/ml，且由于價格低容易制備，是現在實驗室里常用于細胞器、病毒、RNA分離的梯度材料，但由于有較大的滲透壓，不宜用于細胞的分離。
　　⑵聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll-400也就是相對分子重量為400000，Ficoll滲透壓低，但它的粘度卻特別高，為此常與泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分離各種細胞包括血細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞、鼠肝細胞等。
　　⑶氯化銫：是一種離子性介質、水溶性大，最高密度可達1.91g/ml。由于它是重金屬鹽類，在離心時形成的梯度有較好的分辨率，被廣泛地用于DNA、質粒、病毒和脂蛋白的分離，但價格較貴。
　　⑷鹵化鹽類：KBr和NaCl可用于脂蛋白分離，KI和NaI可用于RNA分離，其分辨率高于銫鹽。NaCl梯度也可用于分離脂蛋白，NaI梯度可分離天然或變性的DNA。
　　⑸Percoll：是商品名，它是一種SiO2膠體外面包了一層聚乙烯吡咯酮（PVP），滲透壓低，它對生物材料的影響小，而且顆粒穩定，在冷卻和凍融情況下還是穩定的，其粘度高，且在酸性pH和高離子強度下不穩定。它可用于細胞、細胞器和病毒的分離。

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